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    关于层析柱装柱、使用及相关注意事项

    2011-06-06 18:59:12  来源：姚玉菊

    关于层析柱装柱、使用及相关注意事项

    （1）、装柱前要仔细看填料的使用说明书，每种填料都有自己的特性，以及特殊的装柱方法，针对不同的空柱，也要注意方法可能不同；

    3、这一点非常重要：装柱包括以后使用中绝对不允许柱内进入气泡（bubble free），柱头事先也要排除气泡。

    （2）、填料要加水搅拌成均匀悬液，悬液浓度依填料而不同，一般70－85%，迅速倒入空柱内，或吸或压，流速和具体步骤看说明书。

    （3）、所有柱子尽量做到填料均匀，尤其是用于凝胶层析的柱子。装柱完成后，可用柱效测定的方法检查装填效果。一个装填合格的柱子的理论塔板高度应是填料平均粒径的2－4 倍，在此范围内越小越好。

    （4）、选择合适的泵，首先是流速满足要求，脉冲尽量小。首选柱塞泵。

    （5）、准备上柱的液体应进行过滤，至少是0.45micrometre。

    （6）、关于纯化，首先要考虑的是你的目标：纯度、数量、速度、收率等等，再根据样品的具体情况，尤其是目标蛋白的性质，确定纯化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。*步先从大量或复杂样品中将目标蛋白%26ldquo;抓出%26rdquo;，与主要杂质分离；再用高选择性的层析去除绝大部分杂质；*后精细纯化，提供纯度至设定目标。到实际工作中，不要死靠三步，也许一步也许四步或更多，具体情况具体分析。所谓%26ldquo;三步%26rdquo;只是一种思路而已。

    （7）、至于测序，我想大概不到1mg 应该足够了。

    常压反相硅胶柱的使用注意事项

    C18反相硅胶的预处理很简单，就是用甲醇浸泡即可。上海五相仪器对其使用作如下说明：使用的时候，将C18反相硅胶用甲醇混匀，搅拌，可以稍微超声脱气泡但不可时间太长，5分钟吧。然后匀浆装柱，用甲醇冲洗柱子2-3个柱体积，将C18中的交联剂之类洗掉，然后用你的洗脱剂冲洗主子2-3个柱体积。洗脱剂的选择可以根据液相也可以根据反相板。如果根据液相的话，需要将液相条件中的有机相减小10%作为洗脱剂为好。然后将你的带分离物质用洗脱剂溶解，上样，加洗脱剂冲就可以了。反相硅胶可以反复使用，使用次数增多以后，有可能在柱子顶端产生颜色很深的色带，可以选择用丙酮冲洗，如果洗不掉可以选择将其挖去，然后将主子内C18硅胶保存在甲醇中即可。注意不要甲醇干了。


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    俞松鹤
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